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本试剂盒适用于快速从福尔马林固定、石蜡包埋组织样品中提取RNA包括microRNA，RNA可直接用于反转录PCR，荧光定量PCR。

本试剂盒采用独特的裂解液/蛋白酶K迅速裂解细胞释放出RNA，然后裂解混合物通过一个基因组DNA清除柱，基因组DNA被清除而RNA穿透滤过。滤过的RNA用乙醇调节结合条件后，RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤，去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的RNase free H20将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。

• 完全不使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
  
• 快速，简捷，单个样品RNA提取操作一般可在1小时内完成。
  
• 试剂盒的独特基因组清除柱和配方确保有效清除基因组DNA残留，一般情况下得到的RNA不需要DNase消化，可直接用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。
  
• 多次柱漂洗确保RNA高纯度，可直接用于下游各种实验。

• 所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。
  
• 不合适的储存于低温（4℃或者-20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15℃～25℃）进行。
  
• 为避免降低活性，方便运输，提供蛋白酶K为冻干粉状，收到后，可短暂离心后，加入0.5毫升灭菌水溶解。因为反复冻融可能会降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量)分装冻存，-20℃保存。
  
• 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

• 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C或者类似离心机。
  
• 样品处理量绝对不要超过基因组DNA清除柱和RNA吸附柱RA处理能力，否则造成DNA残留或者产量降低。不同组织细胞种类RNA/DNA相差极大，例如胸腺脾脏DNA含量丰富，超过5mg就会超过柱子处理能力。COS细胞RNA含量丰富，超过3×10⁶细胞就会超过柱子吸附能力。所以开始摸索实验条件时，如果不清楚样品DNA/RNA含量时宁可使用较少的样品处理量，如不超过2个10μm厚度石蜡切片。将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。
  
• 裂解液PKD、结合液RBC中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
  
• 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶中加入指定量无水乙醇!

• 修整去除过量包埋组织外石蜡，并切片成10～20μm厚切片。
  切片厚度必须≥10μm，否则太薄会切碎细胞，造成脱蜡过程中microRNA丢失。
  
• 收集总厚度不超过■40μm的石蜡切片到一个1.5～2mL离心管（例如2片20μm、4片10μm的石蜡切片），或者不超过▲80μm的石蜡切片到一个2mL离心管。
  ■代表处理切片总厚度≤40μm，▲代表处理切片总厚度≤80μm。
  
• 加入1mL 100%二甲苯，涡旋振荡10秒。瞬间离心把组织全部浸入到二甲苯。
  
• 50℃水浴3分钟熔解石蜡，20～25℃最高速离心2分钟，收集组织到管底。
  
• 小心用移液器吸弃上清二甲苯，注意不要吸到沉淀。
  
• 加入1mL无水乙醇，涡旋振荡，最高速离心2分钟，小心吸弃上清乙醇。
  
• 加入1mL无水乙醇，重复步骤6一遍，尽可能吸弃所有乙醇。
  
• 室温或者37℃晾干乙醇10分钟或直到所有乙醇挥发干。
  
  • 乙醇完全晾干非常重要，微量的乙醇残留也会导致RNA产量降低。
• 吹打或者涡旋振荡充分重悬组织沉淀在■150μL ▲240μL裂解液PKD中，短暂离心收集液体到管底，加10μL蛋白酶K，吹打混匀。
  
• 55℃孵育15分钟，然后80℃孵育15分钟。
  
  • 55℃孵育后，可以将离心管取出放置在室温，等水浴锅温度升到80℃后再放入水浴锅，精确的孵育15分钟。即使2分钟的延长也可能导致RNA的部分降解。
• 加入■320μL ▲500μL结合液RBC，充分吹打混匀调节结合条件。
  
• 立刻将混合物加入一个基因组DNA清除柱中，（清除柱放入收集管中）14000rpm离心30秒，保留滤过液（RNA在滤过液中）。
  
  • 应避免吸到可能有的较大的未消化完全的絮团物质上柱子，以免堵塞离心柱。
• 加入■1120μL ▲1750μL无水乙醇到滤过液中，立即吹打混匀，不要离心。
  
  • 如果加1750μL无水乙醇，应先将滤过液转到容量超过3mL的离心管后再加入。
• 立刻将混合物(每次小于700μL，多可以分多次加入)加入一个RNA吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13000rpm离心30秒，弃掉废液。
  
• 加入500μL漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），12000rpm离心30秒，弃掉废液。加入500μL漂洗液RW，重复一遍。
  
• 将吸附柱RA放回空收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
  
• 取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30μL RNase free water（事先在70～90℃水浴中加热可提高产量），室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟。
  
  • 洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要RNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积，如果需要RNA浓度高，可以将洗脱液放回吸附柱RA，再洗脱一遍。

• 预防RNase污染，应注意以下几方面：
  
  • 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。
    
  • 使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。
    
  • RNA提取过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
    
  • 配制溶液应使用无RNase的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%(v/v)，37℃放置过夜，高压灭菌。）
• 关于DNA的微量残留：
  一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留（DNase消化也无法做到100%无残留），本试剂盒，由于采取了本公司独特的缓冲体系和基因组DNA清除柱技术，绝大多数DNA已经被清除，可直接用于反转录PCR和荧光定量PCR。个别特殊情况如DNA含量过于丰富造成残留或者要进行严格的mRNA表达量分析荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时：
  
  • 选用跨内含子的引物，以穿过mRNA中的连接区，这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
    
  • 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。
• RNA纯度及浓度检测：
  
  • 完整性：RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15分钟)检测完整性。由于石蜡包埋组织福尔马林固定和包埋过程中一般由于RNA与蛋白反应交联会导致RNA断裂或者降解，一般电泳后UV下只能看到模糊弥散（smear）带型，随着储存的时间越长，降解断裂越严重，甚至只能看到峰值仅仅在100bp左右的模糊条带。这都属于RNA提取正常情况。
    
  • 纯度：OD260/OD280比值是衡量蛋白质污染程度的参考指标。高质量的RNA，OD260/OD280读数（10mM Tris,pH7.5）在1.8～2.1之间。OD260/OD280读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品，假定在10mM Tris，pH7.5溶液中测出的OD260/OD280读数1.8～2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5～1.9之间，但这并不表示RNA不纯。
    
  • 浓度：取一定量的RNA提取物，用RNase-free水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260,OD280测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：
    
    终浓度（ng/μl）= (OD260)×(稀释倍数n)×40